Der italienische Mathematiker, Physiker und Philosoph wurde am 15. Februar 1564 in Pisa geboren. Er war der Sohn eines wenig begüterten florentinischen Tuchhändlers, Musikers und Musiktheoretikers, der seinerseits „musik-physikalische“ Untersuchungen anstellte.
Der kleine Galilei, der später sagte er habe mit dem Gedanken gespielt, Maler zu werden, wurde zunächst in einem Kloster (Vallombroso) als Novize erzogen, bevor er ab 1581 auf Wunsch seines Vaters ein Medizinstudium an der Universität Pisas begann. Doch nach drei oder vier Jahren des Medizin- und Philosophiestudiums entschied er sich für einen Wechsel und studierte von nun an die mehr in seinem Interesse stehenden Fächer der Naturwissenschaften und Mathematik. Er beendete das Studium ohne Abschluss und ging 1985 nach Florenz um seine Studien privat fortzusetzen.
Als 26-Jähriger wurde Galilei, der sich lange mit den Schriften des Aristoteles beschäftigt hatte, auf Grund seiner guten Beziehungen zum Professor der Mathematik in Pisa ernannt. Die Stelle wurde jedoch nicht sehr gut vergütet und so bekam Galilei, als 1591 sein Vater starb und er dadurch für Mutter, drei jüngere Geschwister und die Mitgift der älteren Schwester aufkommen musste, finanzielle Probleme. Aus diesem Grund ging er im darauffolgenden Jahr als Professor für Mathematik und Physik nach Padua, was eine etwas besser besoldete Stelle darstellte. Nebenbei gab er noch – aus demselben Grund – Privatunterricht an einige Schüler aus begütertem Elternhaus.
Ein weiterer Aufstieg wurde Galilei, der inzwischen schon einige nennenswerte Entdeckungen gemacht hatte, im Jahre 1610 ermöglicht, indem er als Hofmathematiker des Großherzogs von Florenz Cosimo de Medici (sein ehemaliger Schüler) in Florenz angestellt wurde. Hierdurch erhoffte sich Galilei neben einer besseren Bezahlung auch mehr Zeit und Freiheit für seine Experimente. Gleichzeitig trennte er sich aber auch von seiner Haushälterin Marina Gamba, mit der er elf Jahre lang eine Beziehung geführt und drei Kinder hatte, die in den Jahren 1600, 1601 und 1606 zur Welt kamen.
1611 reiste Galilei erstmals nach Rom, mit der Absicht die kirchliche Oberbehörde von der Richtigkeit des kopernikanischen Weltbildes zu überzeugen, was ihm aber nicht gelang.
In der Folgezeit nutzte er die ihm gegebenen Möglichkeiten, indem er weitere Experimente anstellte und seine Ergebnisse und Gedanken veröffentlichte.
1632 erscheint das Werk, das Galilei zum Verhängnis werden sollte: Dialogo di Galileo Galilei sopra i due Massimi Sistemi del Mondo Tolemaico e Copernicano (Dialog über die zwei wichtigsten Weltsysteme, das Ptolemäische und das Kopernikanische).
Nachdem Galileis Versuche, die Kirche zu überzeugen bisher fehlgeschlagen waren, erhoffte er sich neue Chancen bei dem 1618 neu eingesetzten Papst Urban VIII. Da sein erstes Werk „Il Saggiatore“ („Prüfer mit der Goldwaage“) keine Beachtung fand, veröffentlichte Galilei eben 1632 dieses Buch, mit dem er die Menschen auf eine besondere Art und Weise vom neuen Weltbild überzeugen wollte: Er lies einen Vertreter des Ptolemäischen und einen des Kopernikanischen Weltsystems miteinander diskutieren, wobei der Vertreter des Kopernikanischen schlussendlich die deutlich besseren Argumente anführt und somit gewinnt. Diese Diskussion wurde von den Offiziellen des Vatikans nicht mehr für eine hypothetische Schreibweise gehalten und sie verhängten deshalb ein Druckverbot. Kurz darauf wurde der Fall der Inquisition übergeben und Galilei wurde zum Papst nach Rom bestellt. Auf Grund gesundheitlicher Probleme verzögerte sich seine Reise noch etwas, bis er schließlich im April 1633 offiziell vernommen wurde. Der nun begonnene Prozess, während dessen Galilei auch einige Tage ein Apartment der Inquisition beziehen musste, endete am 22. Juni 1633 mit dem Widerruf der Theorie des 69-Jährigen. Unter Androhung der Folter verlies Galilei vor den Kardinälen kniend folgenden Text, der ihm von der Inquisition vorbereitet worden war:
„Ich, Galileo Sohn des Vinzenz Galilei aus Florenz, siebzig Jahre alt, stand persönlich vor Gericht und ich kniete vor Euch Eminenzen, die Ihr in der ganzen Christenheit die Inquisitionen gegen die ketzerische Verworfenheit seid. Ich habe vor mir die heiligen Evangelien, berühre sie mit de Hand und schwöre, dass ich immer geglaubt habe, auch jetzt glaube und mit Gottes Hilfe auch in Zukunft glauben werde, alles was die heilige katholische und apostolische Kirche für wahr hält, predigt und lehrt.Es war mir von diesem Heiligen Offizium von Rechts wegen die Vorschrift auferlegt worden, dass ich völlig die falsche Meinung aufgeben müsse, dass die Sonne der Mittelpunkt der Welt ist, und dass sie sich nicht bewegt, und dass die Erde nicht der Mittelpunkt der Welt ist, und dass sie sich bewegt. Es war mir weiter befohlen worden, dass ich diese falsche Lehre nicht vertreten dürfe, sie nicht verteidigen dürfe und dass ich sie in keiner Weise lehren dürfe, weder in Wort noch in Schrift. Es war mir auch erklärt worden, dass jene Lehre der Heiligen Schrift zuwider sei. 
Trotzdem habe ich ein Buch geschrieben und zum Druck gebracht, in dem ich jene bereits verurteilte Lehre behandele und in dem ich mit viel Geschick Gründe zugunsten derselben beibringe, ohne jedoch zu irgendeiner Entscheidung zu gelangen. Daher bin ich der Ketzerei in hohem Maße verdächtig befunden worden, darin bestehend, dass ich die Meinung vertreten und geglaubt habe, dass die Sonne Mittelpunkt der Welt und unbeweglich ist, und dass die Erde nicht Mittelpunkt ist und sich bewegt. Ich möchte mich nun vor Euren Eminenzen und vor jedem gläubigen Christen von jenem schweren Verdacht, den ich gerade näher bezeichnete, reinigen. Daher schwöre ich mit aufrichtigem Sinn und ohne Heuchelei ab, verwünsche und verfluche jene Irrtümer und Ketzereien und darüber hinaus ganz allgemein jeden irgendwie gearteten Irrtum, Ketzerei oder Sektiererei, die der Heiligen Kirche entgegen ist. Ich schwöre, dass ich in Zukunft weder in Wort noch in Schrift etwas verkünden werde, das mich in einen solchen Verdacht bringen könnte. Wenn ich aber einen Ketzer kenne, oder jemanden der Ketzerei verdächtig weiß, so werde ich ihn diesem Heiligen Offizium anzeigen oder ihn dem Inquisitor oder der kirchlichen Behörde meines Aufenthaltortes angeben.
Ich schwöre auch, dass ich alle Bußen, die mir das Heilige Offizium auferlegt hat oder noch auferlegen wird, genauestens beachten und erfüllen werde. Sollte ich irgendeinem meiner Versprechen und Eide, was Gott verhüten möge, zuwiderhandeln, so unterwerfe ich mich allen Strafen und Züchtigungen, die das kanonische Recht und andere allgemeine und besonders einschlägige Bestimmungen gegen solche Sünder festsetzen und verkünden. Dass Gott mir helfe und seine heiligen Evangelien, die ich mit den Händen berühre.
Ich, Galileo Galilei, habe abgeschworen, geschworen, versprochen und mich verpflichtet, wie ich eben näher ausführte. Zum Zeugnis der Wahrheit habe ich diese Urkunde meines Abschwörens eigenhändig unterschrieben und sie Wort für Wort verlesen, in Rom im Kloster der Minerva am 22. Juni 1633. Ich Galileo Galilei, habe abgeschworen und eigenhändig unterzeichnet.“
Der Legende nach soll Galilei, der an seiner Überzeugung festhielt, beim Verlassen des Gerichtssaals folgende Worte gemurmelt haben: „Eppur si muove" („Und sie [die Erde] bewegt sich doch").
Galilei wurde zu unbefristeter Haft in seinem Landhaus in Arcetri bei Florenz verurteilt. Diese „unbefristete Haft“ bedeutetet Hausarrest und das Verbot jeglicher Lehrtätigkeit. Nicht einmal ein Arztbesuch war ihm gestattet.
Galilei blieb also bis zu seinem Tode ein Gefangener der Inquisition.
1637 erblindete der schon immer unter Sehschwächen leidende Galilei vollständig auf beiden Augen. Man vermutet, dass dies eine Folge seiner anfangs ohne ausreichenden Schutz unternommenen Sonnenbeobachtungen war. 
(Auch dieses Augenleiden hatte Galilei mit Kepler gemein.)
Am 8. Januar 1642 starb Galileo Galilei in Arcetri. Ein feierliches Begräbnis in einem ehren- und prunkvollen Grab, das der Großherzog vorgesehen hatte, wurde dem italienischen Wissenschaftler jedoch verwehrt.
Doch hiermit war der Fall Galilei noch nicht abgeschlossen. Neben seinem Ansehen, das er in der Wissenschaft genießt, befasste sich auch die katholische Kirche noch einmal mit dem einstigen „Ketzer“. 1979 beauftragte Papst Johannes Paul II. die Päpstliche Akademie der Wissenschaft, den berühmten Fall aufzuarbeiten.
Am 31. Oktober 1992 hielt Johannes Paul II. eine Rede, die zum einen als Entschuldigung und zum anderen als Heilung des gegenseitigen Missverstehens von Wissenschaft und Kirche gesehen wird.
Am 2. November 1992 wurde Galileo Galilei schließlich formal von der römisch-katholischen Kirche rehabilitiert.